禽流感H9N2滅活苗的研制及免疫效果的評價_企業動態_媒體中心

摘要

禽流感（Avian Influenza，AI）是由A型流感病毒引起的禽類感染疾病綜合癥，分為高致病性禽流感（HPAI）和低致病性禽流感（LPAI)。H9N2亞型禽流感為低致病力禽流感。1994年我國大陸首次從雞體內分離出H9N2亞型禽流感病毒，此后，該病毒開始在我國雞群內蔓延，給養禽業造成巨大的經濟損失。疫苗免疫是主要的防疫手段。本公司旨在開發高效、廉價、性價比高的禽流感疫苗。項目設計從細胞株篩選、反應器培養、產毒評估及動物實驗，到后續放大至生物反應器進行全懸浮培養細胞生產病毒疫苗，生產批間差異小，成本低廉，易于放大。本工作目的在于摸索成熟穩定的生產工藝，并應用于大規模生產，制備高效廉價的禽流感疫苗。

一

前言

禽流感病毒屬于正粘病毒科流感病毒屬A型流感病毒，A型流感病毒宿主極其廣泛。A型流感病毒的致病性與毒株和宿主均有很大關系，不同毒株對同一宿主或同一毒株對不同宿主的致病性差異很大。H9N2亞型AIV在我國涉及范圍最為廣泛，發病率、死亡率低，但其危害也不容忽視。該病毒除造成禽呼吸道疾病外，還侵害家禽的生殖系統，使蛋雞產蛋量急劇下降或者產蛋達不到高峰：肉雞感染后生長緩慢，降低料肉比；H9亞型AIV易與其他病毒病(如雞新城疫等)或細菌病(如大腸桿菌病等)混合感染，可造成較高的死亡率。犬腎上皮細胞(Madin-Darby canine kidney cells，MDCK)對流感病毒敏感性高，成為流感疫苗生產的最佳宿主之一。本文對前期實驗室已成功懸浮馴化的MDCK-10進行穩定性驗證及產毒評估，再到動物實驗。從搖瓶小試工藝開發，到中試及生物反應器大規模生產進行全方位的工藝摸索，從而更新現階段以雞胚為原料進行生產的固有工藝，為國內低致病性禽流感生產型企業進行全懸浮無血清大規模生產奠定數據基礎。

二

實驗材料與方法

實驗材料

細胞株及病毒株

MDCK-10懸浮細胞由蘇州沃美生物有限公司自行馴化所得；H9N2亞型禽流感種毒為本實驗室分離株，在SPF雞胚上進行擴繁復壯，收獲后作為本實驗用毒，其雞胚半數感染量(50%egg infectious dose，EID₅₀)為 8.50 LgEID₅₀/0.2mL。

主要試劑及儀器

MS01A無血清懸浮培養基為本公司自主研發；胰酶購自Gibco；250mL、500mL及1L搖瓶購自美國Corning公司；自動計數儀購自上海睿鈺生物科技有限公司；14L和35L玻璃反應器購自蘇州迪歐益生物科技有限公司；200L不銹鋼生物反應器購自蘇州迪歐益生物科技有限公司。

方法

搖瓶傳代培養

將指數生長期的懸浮 MDCK-10 細胞以1.5×10⁶cells/mL 左右的密度接種于康寧搖瓶中，裝液量為搖瓶總體積的20-30%，置于 37℃、5% CO₂、130 r/min 培養箱中培養；后續連續傳代為用新鮮培養基將細胞液稀釋至 1.5×10⁶ cells/mL，每48h傳代一次。細胞連續傳代40代以上，進行細胞狀態觀察及數據匯總，為細胞連續稀釋傳代穩定性做數據支持。

14L反應器連續傳代培養

懸浮MDCK-10上罐14L玻璃生物反應器，培養體積6L，細胞以1.5×10⁶cells/mL 左右的密度接種上罐，稀釋比為1:6，控制反應器參數：溫度：37℃；轉速60rpm；pH7.15;DO：60%。在反應器上進行連續稀釋傳代培養，連續1:6稀釋穩定傳代10代左右。對比在攪拌式反應器上細胞培養的連續性及重復性。

搖瓶接毒工藝（H9N2亞型）

MDCK-10細胞正常培養48h左右，密度增殖至8-10×10⁶cells/mL，按新鮮培養基與細胞液體積比為1:1稀釋細胞液，接種于250mL搖瓶，裝液量50mL，設置不同接毒比例，分別為稀釋后培養體積的千分之一，萬分之一，十萬分之一，胰酶添加濃度為10μg/mL，置于37℃、5% CO₂ 培養箱中培養，搖床轉速為130 r/min。分別在培養48h，72h收取病毒液，凍融一次后采用雞紅細胞凝集價測定病毒滴度。確定最佳MOI與收獲時間。

14L反應器工藝驗證及制滅活疫苗的制備

懸浮MDCK-10上罐14L玻璃生物反應器，培養體積6L，密度增殖至8-10×10⁶cells/mL，按新鮮培養基與細胞液體積比為1:1稀釋細胞液，分別以萬分之一培養體積比接種H9F6株、H9C1株、H9C2株、H9CD株，胰酶添加濃度為10μg/mL，控制反應器參數：溫度：37℃；轉速60rpm；pH7.15;DO：60%。培養48-72h后收取病毒液，凍融一次后取樣測定病毒滴度。按終濃度0.1%的比例加入37%的甲醛溶液，至37℃滅活24h，期間每4h攪拌一次。接種雞胚測定滅活效果：接種于9-11日齡SPF雞胚，每枚雞胚接種0.1mL，置37℃孵育。24h照胚，非特異性死亡應不超過1枚。24h后每日照胚2次，觀察5日。對所有胚液分別測定血凝價，均應不出現血凝。并盲傳一代，測定血凝價，均應不出現血凝，則判定滅活完全。

將四種滅活抗原（H9F6株、H9C1株、H9C2株、H9CD株），分別用滅菌生理鹽水進行2倍稀釋和4倍稀釋，稀釋后加入分別加入6%的吐溫-80，充分混合后為水相，油相為白油。按照水相：油相為1:3的比例乳化制苗。

SPF雞的免疫

取21日齡SPF雞，分為8組，每組10只，第一組到第八組分別為H9F6株稀釋2倍組；H9C1株稀釋2倍組；H9C2株稀釋2倍組；H9CD株稀釋2倍組；H9F6株稀釋4倍組；H9C1株稀釋4倍組；H9C2株稀釋4倍組；H9CD株稀釋4倍組。每組免疫相應滅活疫苗，0.2ml/只。另設空白對照組5只，不做免疫。分別在免疫后14日、21日采血分離血清，測定H9血清抗體效價。

細胞滅活苗與胚苗滅活苗免疫效果對比

（1）細胞滅活苗的制備

按照05和06方法制備H9CD株細胞滅活疫苗。

（2）胚毒滅活苗的制備

將H9CD株用滅菌生理鹽水稀釋10^-4-10^-5，經尿囊液接種10-11日齡易感雞胚，每胚0.1ml。選擇接種后48-120h內死亡雞胚及120h存活雞胚，置2-8℃冷卻24h，收獲雞胚尿囊液，按照05方法進行滅活及滅活檢驗，按照06方法乳化制苗。

（3）SPF雞的免疫

取21日齡SPF雞，分為2組，每組5只，第一組免疫H9CD株細胞毒滅活疫苗，第二組免疫H9CD株滅活疫苗，0.2ml/只，另設空白對照組5只，不做免疫。分別在免疫后14日，21日采血分離血清，測定H9血清抗體效價。

三

結果

搖瓶傳代培養研究

搖瓶連續培養40代，細胞密度穩定在8.8×10⁶cells/ml-9.6×10⁶cells/ml之間，細胞活率穩定在97%-99%之間，表明MDCK細胞在搖瓶上可以穩定傳代。

反應器連續稀釋培養分析

MDCK-10細胞在14L反應器連續稀釋培養10代，細胞密度穩定在8.9×10⁶cells/ml-9.4×10⁶cells/ml之間，葡萄糖殘量在培養F1-F5時持續下降，培養F6-F10時穩定在1.0g/L~1.5g/L，表明MDCK-10細胞在14L反應器上能夠穩定傳代。

搖瓶接毒工藝優化探索

在搖瓶上按不同接毒比例接種H9毒株，接毒后分別在48h、72h、96h取樣，凍融一次后測定病毒含量。結果顯示按0.001%體積比接毒時，病毒效價在72h達到高峰，雞紅細胞凝集價為9log2HAU/25ul；按0.01%、0.1%體積比接毒時，病毒效價均在72h達到高峰，雞紅細胞凝集價為11log2HAU/25ul。為了節省種毒在大生產上的使用量，確定最佳接毒比例為培養體積比的0.01%，收獲時間為接毒后72h。

接毒后不同時間點取樣細胞計數，并測定細胞活率。結果顯示不同接毒比例細胞數在培養48h內有所上升，48h后細胞數開始下降；不同接毒比例細胞活率在接毒后持續下降，96h后細胞活率僅在20%-26%之間，且接毒比例越高，細胞活率下降越快。

反應器接毒驗證及疫苗的制備

H9F5株、H9C1株、H9C2株、H9CD株四種毒株接種14L反應器，72h收獲凍融一次測定病毒含量，四種毒株的血凝價均為1:1024，雞胚半數感染量H9CD株略高8.6lgEID₅₀/0.2

ml，H9C1株最低，為8.6lgEID₅₀/0.2ml。將四種抗原用0.1%甲醛溶液滅活后，做滅活檢驗，四種抗原滅活檢驗均合格。將抗原分別用滅菌生理鹽水進行2倍稀釋和4倍稀釋后乳化制備疫苗。

免疫SPF血清抗體效價結果

將制備疫苗免疫21日齡SPF雞，免疫21日后采血測定血清抗體效價，結果顯示，免疫14日及21日后，2倍稀釋組抗體效價均高于4倍稀釋組。免疫14日后，H9C2株免疫血清抗體效價最低，2倍稀釋為1:2^5.5，4倍稀釋為1:2^3.6；H9CD株免疫抗體效價最高，2倍稀釋為1:2^8.7，4倍稀釋為1:2^7.4。免疫21日后H9C1株免疫血清抗體效價最低，2倍稀釋為1:2^5.2，4倍稀釋為1:2^4.4；H9CD株免疫抗體效價最高，2倍稀釋為1:2^9.4，4倍稀釋為1:2^8.6。根據14日及21日血清抗體效價結果，篩選出H9CD株為疫苗株，進行后續試驗。

注：空白對照組5只血清抗體效價均為0

細胞滅活苗與胚苗滅活苗免疫效果對比

將H9CD株分別用細胞及非免雞胚進行擴增，測定半成品抗原效價，細胞毒雞紅細胞血凝價為1:2048，雞胚半數感染量為8.75lgEID₅₀/0.2ml；胚毒雞紅細胞血凝價為1:2048，雞胚半數感染量為8.6lgEID₅₀/0.2ml。將三種抗原用0.1%甲醛溶液滅活后，做滅活檢驗，三種抗原滅活檢驗均合格，乳化制備疫苗。將疫苗免疫21日齡SPF，免疫14日、21日采血測定血清抗體效價。結果顯示在免疫14日后，混合組苗抗體效價平均值為1:2^8.4，高于胚毒的1:2^6.8和細胞苗的1:2^7.28；免疫21日后，細胞苗和胚苗兩組抗體效價相當，細胞毒抗體效價平均值為1:2^10.2，胚毒為1:2^10.4。說明細胞毒與胚毒免疫效果相當，且細胞毒抗體產生比胚毒快?；旌辖M苗的效價平均值為1:2^11.2，均高于細胞毒和胚苗，說明混合組苗既有胚苗良好的免疫原性，又兼顧了細胞苗免疫快速應答。

四

結論

1、在細胞培養過程中，確定了搖瓶培養過程中，裝液量20-30%細胞均能正常增值，且保持良好的細胞狀態，在反應器連續培養過程中，確定了參數：溫度：37℃；轉速60rpm；pH7.15;DO：60%，細胞能在14L反應器上進行連續稀釋傳代，細胞增值穩定，且培養基營養物質豐富，可以保持細胞良好狀態，并進行后續接毒；

2、通過毒株篩選動物實驗，確定了H9N2-CD株免疫效果最好，抗體產生更快更高；

3、與傳統胚苗對比，細胞苗完全不弱于胚苗，且免疫效果相當，但混合使用效果更好。

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