使用本公司研發的個性化培養基對雞肝癌細胞（LMH細胞）多代次的懸浮傳代培養，考察細胞生長和FAdV-4擴增的穩定性。進一步采用單因素實驗法檢測病毒感染復數（MOI）、培養液稀釋比例等工藝參數對病毒效價的影響。建立了LMH細胞懸浮培養擴增FAdV-4的生產工藝，操作簡便，易于放大，為當前FAdV-4C疫苗的滾瓶生產工藝替代成大規模的反應器生產工藝奠定了基礎。

      Ⅰ群禽腺病毒呈世界性分布，各年齡段家禽均易感，在我國雞群中發病率較高，全國范圍內均有流行，并且2010年后逐年上升趨勢。Ⅰ群禽腺病毒的宿主范圍越來越廣，白羽肉雞、肉種雞、蛋雞、黃羽雞均可感染發病。FAdV-4C屬于Ⅰ群禽腺病毒，能引起的心包積水肝炎綜合征(HHS)，導致產蛋下降甚至死亡(死亡率在20％～80％)。主要病理變化是心包腔中有淡黃色清亮的積液，肝臟腫大、蒼白，腎臟腫大，心臟和肝臟出現多發性局灶性壞死，肝細胞中見核內包涵體。FAdV-4C對雛雞的致病力最強，可通過接觸水平傳播及垂直傳播，對我國養雞業造成了嚴重的經濟損失。

      LMH細胞（雞肝癌細胞）對禽腺病毒病毒敏感性較高，成為腺病毒疫苗生產的最佳宿主之一。在我國，LMH細胞培養以貼壁細胞培養為主，操作繁瑣且需要使用高比例進口血清，成本較高和批間質量不穩定等問題突出。乃至無血清的懸浮培養工藝則更具優勢。然而，疫苗生產用的懸浮LMH細胞的傳代穩定性尚未探明，LMH細胞懸浮適應后的產毒能力及相應的工藝也需要詳細的實驗研究。

      本文采用高產株的LMH懸浮細胞株作為出發細胞株，應用自主研發的培養基對其傳代培養8個月，考察其在懸浮培養中生長的穩定性，并在搖瓶中建立病毒Ⅰ群禽腺病毒擴增工藝。

將生長無異常的懸浮LMH細胞按照接種密度1.0~1.2×10⁶ cells/ml，每三天（72h）稀釋傳代，37℃搖床內培養，連續傳代中考察細胞生長的穩定性。在搖瓶建立接毒工藝并優化MOI和稀釋比例等工藝參數。

     搖瓶連續傳代累計240天，細胞形態保持良好，表面光滑圓潤，均呈大小均一的球形，稍有結團，每代次培養72h的細胞密度均可達到5.0~7.0×10⁶ cells/ml，表明該培養體系的傳代培養穩定性較好，細胞培養狀態如圖1，傳代200多天后的細胞生長曲線如圖2。

圖1  培養72h細胞狀態圖

 圖2  LMH細胞生長增殖表

    MOI

    接種密度1.0~1.2×10⁶ cells/ml培養72h稀釋接毒，置于37℃搖床內培養，相同稀釋比例（即接毒密度）以不同的MOI進行接毒，每24h取樣計數觀察，留樣檢測TCID₅₀/ml效價，結果顯示（圖3）。MOI越低，接種病毒后所能達到的最高TCID₅₀效價（TCID₅₀max）出現時間越晚；相反，MOI越高，TCID₅₀max出現時間越早。MOI為0.5和1.0時，HAmax均在接毒72~96h較高，其中實驗組基本均可達9.0lgTCID₅₀/ml以上，最高達到9.5lgTCID₅₀/ml。

圖3  不同MOI下，FAdV-4在LMH細胞中的增殖效果

     接種密度1.0~1.2×10⁶ cells/ml培養72h稀釋接毒，置于37℃搖床內培養，相同的MOI=1.0下以不同的接毒密度（即稀釋比例）接毒，每24h進行取樣計數觀察，并留樣檢測TCID₅₀，結果顯示（圖4）。接毒密度越低，接種病毒后所能達到的最高TCID₅₀效價（TCID₅₀max）出現越早，反之，接種密度越高，TCID₅₀max出現時間越晚，其中實驗組基本均可達9.0lgTCID₅₀/ml以上，最高達到9.33lgTCID₅₀/ml。

圖4 不同接毒密度下，FAdV-4在LMH細胞中的增殖

        本研究表明本公司實驗室馴化的LMH懸浮細胞在配套的個性化培養基中累計傳代培養240天效果良好，其傳代培養穩定，且細胞各代次細胞形態良好，表面光滑圓潤，72h細胞計數可達5.0~7.0×10⁶ cells/ml；同時在最佳的接毒條件下（即最佳接毒比例或MOI），接種貼壁培養制備種毒(效價為7.8~8.3lgTCID₅₀/ml)最高效價為9.50lgTCID₅₀/mL，且本研究建立的懸浮培養體系在中試反應器懸浮培養放大生產中已經得到了初步的實踐論證，為后續的大規模批次生產提供了技術思路與支持。