1.1 分析超速離心法

最初的高速離心機主要用于研究細胞的“提取物”，這種應用和金屬材料的限制意味著：樣品的體積必須盡量小，于是設計了帶透明窗的轉頭，以便在離心期間測定離心池中顆粒的分布，有種特制的分析轉頭，它帶有分析池，可注入待分析的樣品。分析樣品是均一的懸液，將轉頭加速到它的操作速度，樣品顆粒按一定速度下沉，它們的大小、形狀和離心力決定了它們的沉降速度。因此，如果分析樣品是僅含一種顆粒的均一懸液，在分析池內由于顆粒不斷沉降，一個清晰的界面將向池底慢慢移動。如果分析樣品是一些顆粒的混合物，則每種顆粒將以它自己的速度沉降。分析超速離心法在這個基本且簡單的基礎上很快發展起來。

1.2 差速沉淀法

差速沉淀法在原理上與分析超離心機中的分離一樣：離心管注入均一的懸液，離心期間，顆粒移向離心管底部，并在底部沉淀。離心時間選擇到剛好足以使所有的最大顆粒都沉淀，這樣得到沒有這種顆粒的上清液，這個上清液可在更高的速度下離心，以分離第二大的顆粒，如此等等。缺點是沉淀將是不均一的，如果控制離心時間使最大顆粒剛好全部沉淀，會造成輕度混雜，更長時間的離心將會造成更多的混雜。

“洗”沉淀物可改進差速離心所取得的分離效果，將沉淀物在均勻的溶于介質中，按原來沉淀過程一樣的條件再離心，可使沉淀物中混有的大小差別很大的顆粒再次分離，混雜度大大降低，盡管如此，但還不能分離大小相近的顆粒。因此，如果需要得到更好的分辨力，則必須使用其它的一些技術。

1.3 速率區帶離心法

速率區帶離心法技術最初是由Brakke（1951）提出的，本質上這個技術是非常簡單的：將小量懸液放在一平緩的密度梯度液上，用此梯度液來穩定顆粒的沉降。由于離心，顆粒離開起始區帶而移動，移動的速度是由顆粒的大小、形狀和它們所受到的離心力來決定的。離心一段時間后，各種顆粒將按它們的相對速度移動而各自分開成一系列區帶。在這種方法中，可毫不困難的分離沉降速度差為20％或差別更小的顆粒，所以速率區帶離心法擴大了差速沉淀法的分離范圍。

和大多數技術一樣，起先存在一些問題，使它在最初的十年中未能推廣使用。速率區帶離心法不能在角轉頭中進行，因為在轉頭加速期間樣品會與梯度液混合，直到目前，甩開轉頭的容量還受到明顯的限制。由于沉降區帶的寬度和起始區帶一樣寬或寬于起始區帶，如果要取得滿意的分離，就要限制裝到轉頭中的樣品的體積。此外，樣品中物質的濃度不應太高，不然，整個帶將與梯度頂部的溶液混合，盡管此技術介紹后不久，Thomson等人便用速率區帶離心法去分離線粒體和溶酶體，但速率區帶離心法最初主要用于分析分離，例如分析聚核糖體樣品的大小，分布或RNA的大小、分布。甩開轉頭設計上的改進，特別是引入區帶轉頭，大大擴展了速率區帶離心法的應用，這正是我們應用的主要方法，這個方法也可使用垂直轉頭。

1.4 等密度區帶離心法

正如Harvy首先指出的那樣，亞細胞顆粒不僅在大小上不同，而且密度也不同。將含有活細胞的懸液放到較細胞密度更大的溶液上，由于離心，細胞在二液交界處成帶。在顯微鏡下檢查時，細胞的內含物似乎已分至若干層內，此分離尚不致殺死細胞，但如果增加離心的速度，細胞可分成兩部分，核與較高密度的碎片在一起。再利用這兩部分的密度差通過在有機溶劑中漂浮的方法可進一步純化核。很久以后，才有通過在密的蔗糖溶液中沉降來純化核的工作。

大多數早期的分離是將顆粒懸于選定密度的液體中，離心后小于介質密度的顆粒懸浮，大于介質密度的顆粒沉淀。分段漂浮的分離方法既費時間又麻煩，特別是分離一種以上的顆粒時更是如此，因此后來的研究者建立了等密度梯度離心技術。將要分離的顆粒懸液放至密度梯度液上，或者實際上將顆粒溶于制作梯度的溶液中，通過離心，顆?；蛘呱细』蛘呦鲁?，到達與它們密度相同的液體處。在這里，它們沒有重量，不管離心的時間多么長，它們再也不移動了。這些顆粒成為一系列的區帶，每種顆粒在它自己的密度區。

這項技術最初用于分析超速離心機，它沒有速率區帶離心法那么多的問題。1959年Beaufay等使用這項技術表明：在過氧化氫的合成和分解中有一組酶，在差速離心時與酶一  體沉降，而實際上它是結合在與溶酶體十分不同的微體顆粒上的（或過氧化物酶體上的）。

從那時以來，等密度梯度離心法已廣泛的應用于生物制品的分離，然而，與速率區帶離心法相比，它有一個主要的缺點是等密度分離期間，顆粒不可避免的暴露在高濃度的梯度溶液中，這可引起顆粒的損傷，并可能出現相當于損傷顆粒的一些格外的區帶。

膜分離過程以選擇性透過膜為分離介質，當膜兩側存在某種推動力（如壓力差、濃度差、電位差等）時，原料側組分選擇性的透過膜，以達到分離目的。通常膜原料側稱膜上游，透過側稱膜下游。不同的膜過程使用的膜不同，推動力也不同。膜分離技術主要分為微濾，超濾，納濾，反滲透。

“色譜法”這一術語是俄國化學家茨維特于1903年首創的。他在白旗柱上用石油醚為溶劑，將綠葉中的色素分成不同顏色的區帶，顧命名為“色譜法”。其后Martin和Synge于1941年發表了液相分配色譜的論文，為液相色譜、氣相色譜、紙色譜和薄層色譜的發展奠定了基礎，為此他們獲得了諾貝爾獎金。在我國于20世紀50年代后開展了這方面的工作，但所用名詞不一致?；瘜W工作者多喜用“色譜法”，而生化工作者多習慣于用“色層法”或“層析”。目前在我國有關這一類方法的名稱尚未統一。

色譜法是用來分離混合物中各種組分的方法。色譜系統包括兩相，固定相和流動相。當流動相流過加有樣品的固定相時，由于各組分在兩相之間的濃度比例不同，就會以不同速度移動而分離開來。固定相可以是固體，也可以是被固體或凝膠支持的液體。固定相可以裝入柱中，展成薄層或涂成薄膜，稱為色譜“床”。流動相可以是氣體，也可以是液體，前者稱為氣相色譜，后者稱為液相色譜。

3.1 凝膠過濾層析

又稱排阻色譜、凝膠滲透、凝膠色譜、分子篩色譜等。是液相色譜技術中以分子大小分離的一項技術。主要應用于組分分離: 脫鹽、更換緩沖液、去除有害試劑，純化蛋白、多肽、多糖等生物分子，計算分子大小及分子的同質性等。它具有快速更換緩沖液，溫和、高產，任何緩沖系統，去除聚體，以大小分離等優點，但缺點是低選擇性和上樣量受限制。若要提高分辨率，則可選擇檢測柱效，檢測分離度，減少上樣體積，降低流速，使用更小的介質顆粒的介質，連接2根層析柱等方法。

3.2 離子交換層析

離子交換色譜法是一種吸附色譜，是以分子的電荷差異來分離的。它以適用于所有的純化階段及所有的規模生產、可控制的、高選擇、高載量、可以濃縮樣品和高回收率等特點而廣泛應用。此外，沒有一種離子交換是非常完美的，選擇正確的離子交換介質至關重要，不同的樣品、不同的純化目的需要不同的離子交換介質。另外，值得注意的是在上樣前對樣品加以處理：去除顆粒物質（離心或過濾的方法），調整pH值及離子強度(使用脫鹽或緩沖液交換的方法)，上樣體積沒有限制，但蛋白含量小于柱載量，注意核酸的影響（陰離子交換）。

3.3 疏水層析

疏水層析是液相色譜技術中按生物分子的疏水性質分離的一項技術，它是對離子交換技術，凝膠過濾技術，親和層析技術的補充。具有溫和，非變性條件純化；也是一種濃縮技術；具有高選擇性，高收率等特點。

3.4 親和層析

親和層析是通過生物分子之間特異性的相互作用分離生物分子的一項技術。它是一門特別容易使用的方法，具有簡單易行，高純度，濃縮樣品等特點。更以純化蛋白質尤為常見，因為它容易使用，一步純化能使純度大于95％，去除特異雜質，快速分離。廣泛的應用于單克隆抗體和多克隆抗體的分離，融合蛋白的分離，酶的分離，DNA結合蛋白的分離，任何蛋白可以結合它的配體。

近年來，在傳統和新型疫苗的制備中，應用先進的分離純化技術是提高疫苗效力降低副反應的有效手段。目前廣泛研發的病毒亞單位疫苗、流腦多糖疫苗、流感嗜血桿菌結合疫苗和各類病毒的核酸(DNA)疫苗等，在研制方式、組成成分和物理、化學性質及原始來源等諸多方面都存在或大或小的差異，其分離純化方法具有相對特殊性。

針對不同的疫苗應選用不同的分離純化路線，但一般而言，都包括兩個基本階段：初級分離和精制純化。初級分離階段的主要任務是分離細胞和培養液，破碎細胞釋放產物(如果產物在細胞內)，濃縮產物和去除大部分雜質等，這一階段可選用的分離方法包括細胞破碎技術、離心沉降、鹽析和超濾濃縮技術等；精制純化階段則選用各種具有高分辨率的技術，以使目的蛋白和少量干擾雜質盡可能分開，達到所需的質量標準，超速離心技術和各種層析技術成為當前達到此目的的主要方法。

從國內外新型疫苗和基因工程產品，在其分離純化技術應用發展現狀可以看出：

①膜分離和超速離心純化技術在疫苗、蛋白組分、多肽及生物大分子的純化過程中有著廣闊的發展前景。用該工藝制備的疫苗，純度和性狀符合規程要求，但抗原回收率相對較低、操作繁瑣且周期長、技術設備要求高，近年來已逐漸為日臻成熟的層析技術所代替，在基因工程疫苗的研制中尤為如此；

②層析分離技術在簡化操作、提高效率、節約能源及降低成本方面，顯示出越來越強的優勢。帶有多功能配基的層析介質和全自動化的高效層析系統的推出，擴大了應用范圍，更便于標準化的實施。在眾多層析法中,親和層析可能成為最有效的，從低濃度培養液中高效分離目的蛋白的純化方法；

③用于傳統疫苗和新型疫苗的純化技術,必須依靠各學科相關技術之間的結合而發展起來的，至今尚無一項技術能單獨承擔分離純化的全過程。創新的分離純化工藝，往往是由多項新技術和原有技術的優勢組合而成。傳統的離心、過濾和沉淀技術更多只是作為整個疫苗分離純化工藝的起始步驟，用于初步分離過程，層析技術與沉淀、離心等傳統分離技術的結合已逐漸成為疫苗分離純化的主流。